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Erstmaliger Nachweis einer Vitalitätsreduktion von Tumorstammzellen aus dem Blut eines Patienten mit Prostatacarcinom durch eine Polyphenolmischung*

* Polyphenole = sekundäre Pflanzenstoffe


Einführung
Mit dem Maintrac-Verfahren wurden bei bisher 5 Patient/Innen mit verschiedenen Tumorerkrankungen in unterschiedlichen Stadien zirkulierende Tumorzellen aus dem Blut extrahiert. Diese Zellen zeigten bei einer Chemoempfindlichkeitstestung durchgängig eine sehr hohe Absterberate von 90 bis 98 % bei Kontakt mit einer Kombination von Polyphenolmischungen. Die Ergebnisse waren bei bis zu drei Verlaufsmessungen bei den einzelnen PatientInnen in höchstem Maße gleichbleibend.
Durch Weiterentwicklung der Methodik ist es nun möglich, Zellen mit Metastasierungspotenzial zu selektieren und zu kultivieren. Auch diese möglicherweise Tumorstammzellen entsprechenden zirkulierenden Tumorzellen zeigten bei einem Patienten eine 90%ige Vitalitätsreduktion bei Kontakt mit der Polyphenolmischung.

Informationen zum Maintrac-Verfahren4/6
Die Erforschung von Oberflächeneiweißen von Tumorzellen reicht in die 90er Jahre des vergangenen Jahrhunderts zurück. Zu den definierten Eiweißen zählt zum Beispiel das Thomsen-Friedenreich-Antigen, das zunächst als spezifisch für Lebertumore eingestuft wurde und nun eher als embryonaler Zellmarker gilt. Ein weiterer etablierter Oberflächenmarker ist das HEA (human epithelial antigen), das von 96 % aller soliden Tumoren gebildet wird.

Der Nutzen dieser Untersuchungen liegt in einer Entdeckung von Tumorzellen außerhalb des Primärtumors. Bildgebende Verfahren einschließlich PET-CT greifen bestenfalls beim Auftreten von Mikrometastasen.
Erste Nachweise von zirkulierenden Tumorzellen gelangen im Knochenmark von Patientinnen mit Brusttumoren. Nächste Ansätze zielten auf eine Isolation von zirkulierenden Tumorzellen aus dem peripheren Blut. Hierfür werden die Eiweiße (Antigene) mit Antikörpern markiert und mit verschiedenen Verfahren konzentriert. Für die Extraktion der Zellen kamen Verfahren wie Cell Search zur Anwendung. Der Nachteil dieser Verfahren war die geringe Ausbeute an vitalen Tumorzellen. Mit dem von Katharina und Ulrich Pachmann entwickelten Maintrac-Verfahren gelang eine vielfach höhere Isolationsrate.

Aktuell werden zur Abtrennung Auto-Antikörper gegen das EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) verwendet. Die Stabilität der Zellen in der Blutprobe ist für einen Zeitraum von 7 Tagen bei Raumtemperatur gewährleistet.
Mit den isolierten Zellen können weitere, den Primärtumor charakterisierende Untersuchungen durchgeführt werden wie Rezeptorbestimmungen (Östrogen-, Progesteron-, Herceptin-Rezeptor).

Pachmann und Kollegen konnten nachweisen, dass zirkulierende Tumorzellen andere Rezeptorausprägungen als der Primärtumor aufweisen können.
Die spontane Apoptose-Rate** der isolierten Zellen kann mikroskopisch über eine Verplumpung von Zellorganellen erfasst werden. Spezifischer und aufwändiger ist der sogenannte Tunnel-Assay, mit dem die Zerhackung (das Shreddern) der Kern-DNA nachgewiesen werden kann.

** Apoptose = programmierter Zelltod

Zur Bedeutung des Nachweises zirkulierender Tumorzellen gibt es mittlerweile eine Fülle von Studien 2/4/5/6/7/9.
Beim Gesunden werden im Rahmen von Operationen große Mengen an epithelialen Zellen in die Zirkulation geschwemmt. Kurze Zeit nach dem Eingriff geht die Zahl wieder auf den minimalen Ausgangswert vor der OP zurück 8.
Bei malignen Tumoren bleibt die Zahl erhöht. Durch Chemotherapie, die zu Zerfall von Tumoren führt, ist ebenfalls ein kurzfristiger Anstieg der Zellzahl möglich. Bei erfolgreicher Therapie sollte die Zahl der Zellen dann abnehmen. Dies ist ein Hinweis auf eine günstige Situation mit geringem Rückfallrisiko. Steigen die Zellzahlen im Verlauf wieder an oder bleiben sie erhöht, ist dies ein ungünstiges Zeichen 10. Zur praktischen Relevanz dieser Befunde gibt es eine neue Studie 6.

Eine offene Frage beim Nachweis zirkulierender Tumorzellen war, welchen Grad der Bösartigkeit bzw. welches Potenzial, Metastasen zu bilden, diese Zellen hatten. Man sprach auch von Schläfer-Zellen (dormant cells), die in einem für sie günstigen Milieu (vernarbtes, z.B. bestrahltes Gewebe, chronisch entzündlich belasteter Organismus, übersäuerte extrazelluläre Matrix) ihr metastatisches Potenzial entfalten könnten.
Aufgrund der Beobachtung, dass auch bei "kurativ behandelten" oder "lokal begrenzten" Tumoren zirkulierende Tumorzellen nachweisbar sind, muss man meines Erachtens beim Nachweis eines bösartigen Tumors immer von einer systemischen Erkrankung ausgehen.
Eventuell schwärmen zirkulierende Tumorzellen frühzeitig aus, um sogenannte metastatische Nischen zu suchen, damit das langfristige Überleben der Tumorzellen gesichert ist, auch wenn der Primärtumor zerstört wird.
Im April 2013 machte Prof. Trumpp vom Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) in Heidelberg publik, dass aus zirkulierenden Tumorzellen von 350 Brustkrebspatientinnen Zellen isoliert werden konnten, die das Potenzial haben, im Mäuseversuch Metastasen zu bilden. Diese Zellen wurden anhand der Oberflächenmarker CD 44, CD 47 und MET von einem Zellsorter isoliert und kultiviert. Trumpp spricht in diesem Zusammenhang von Tumorstammzellen 2/3.***

*** Tumorstammzellen = metastasenbildende, besonders bösartige Tumorzellen

Dr. Pachmann benutzt bei dieser weitergehenden Differenzierung die Marker CD 44 und CD 24, um die sog. Spheroid forming cells (SFC) zu kultivieren 4. Es handelt sich ebenfalls um Zellen, die das Potenzial zu klonaler Vermehrung haben. Diesen SFC wurde von einer chinesischen Arbeitsgruppe im Februar 2013 Stammzellpotenzial zugesprochen 1.

Ablauf der Chemoempfindlichkeitsbestimmung
Bei der Chemoempfindlichkeitsbestimmung werden die Tumorzellen im Labor mit dem zu testenden Medikament / Pflanzenstoff in Kontakt gebracht. Hierbei wird eine einfache Tagesdosis angesetzt, ferner die 10-fache und 0,1-fache Tagesdosis. Hiermit werden Dosis-Wirkungs-Beziehungen geprüft.
Bei den Testungen kam die Kombination von 2 Pflanzenstoffmischungen mit jeweils einer Kapsel zur Anwendung. Der Ansatz wird auf 5 Liter Blutvolumen bei 37°C standardisiert. Dann wird die Aufnahme eines Farbstoffs in den Zellkern mittels mikrofluorimetrischer Bildanalyse gemessen. Dies wird als Befund, der das Absterben der Tumorzellen anzeigt, gewertet. Die Zellkultur wird dann üblicherweise 9 Stunden beobachtet.
Bei den Pflanzenstoffmischungen war der Haupteffekt in den ersten 3 Stunden zu beobachten, nach 9 Stunden war die Wirkung beendet.
Neben der Testreihe mit der Prüfsubstanz läuft eine Leerprobe mit, bei der der spontane Vitalitätsverlust der Tumorzellen ohne Medikamentenzusatz gemessen wird. Diese Veränderung wird mit dem durch die Prüfsubstanz verursachten Effekt verglichen.


Anamnese und Verlauf Patient männlich, 68 J.
04-2012 Prostataentfernung durch die Harnröhre wegen gutartiger Prostatavergrößerung, "Zufalls"-Diagnose eines Prostatacarcinoms
Histologie: inzidentelles, mäßiggradig differenziertes azinäres Prostatacarcinom in weniger als 5 % des resezierten Materials, Gleason 3 + 4 = 7a
TNM pT1a G2,
Empfehlung: Sättigungsgewebeprobe nach 6 Wochen (Urologe Nr.1)
05-2012 DNA - Zytometrie des Materials bei Prof. Biesterfeld, Düsseldorf: peridiploides DNA-Verteilungsmuster, entspr. Typ A modifiziert nach Tribukait. ("Haustierkrebs") ****
Empf. Urologe 2: alle 2 Jahre Kontrolle des DNA-Musters mit Feinnadelbiopsie,
MRT des Beckens *****
07-2012 Prostata-Stanzbiopsie durch weiteren Urologen
(Nr. 3): kein Tumorgewebe
Empf.: kein MRT, PSA-Kontrolle
08-2012 MRT des Beckens und der Prostata:
2 abklärungsbedürftige Befunde der linken und rechten peripheren Zone
Empf.: MRT-gesteuerte Biopsie, nicht durchgeführt
10-2012 Kontrolle bei Urologe Nr. 3,
Empf.: Biopsie nach PSA-Kontrolle in 4-2013, Einschluss in die PREFERE-Studie 11
erste Maintrac-Untersuchung, Kontrolle in 04-2013 und 07-2013
04-2013 erneute Stanzbiopsie im Rahmen der PREFERE-Studie (Urologe Nr. 3), o B, PSA: 1,15 ng/ml
Aktuell: Beschwerden beim Wasserlassen, sonst Beschwerdefreiheit.
  **** DNA-Zytometrie: Untersuchung des Verteilungsmusters von Kernsubstanz (DNA) in Gewebeproben, mit der man den Grad der Bösartigkeit bei Prostatatumoren einschätzen kann
***** MRT = Kernspintomographie

Befundbericht zirkulierender Tumorzellen (Maintrac)
Die Laserscanning-Mikrofluorimetrie der Epithelzellantigen(HEA)-positiven Zellen, mit visueller Kontrolle (MAINTRAC) aus 1 ml EDTA-Blut, ergab folgenden Befund (die Nachweisgrenze liegt bei 10 Zellen/ml):

(Zusatzuntersuchungen: Prostataspezifisches-Antigen (PSA), Prostataspezifisches-Membran­Antigen (PSMA), B7-H3, Androgenrezeptor (AR), Chemosensitivitätstestung, Tumorspheroidforming cells)

  Anzahl tumorverdächtiger Zellen
Untersuchungs-parameter In der Probe Im Kreislauf (5l)(in Millionen) Bei Zusatzuntersuchungen:
% der -HEA-pos. Zellen
Apoptose-
zeichen
 
HEA
250
1,25
keine
wenige
PSA
63
0,31
25,0%
PSMA
63
0,31
25,0%
B7-H3
42
0,21
16,7%
AR
0
0
0%
Spheroidforming cells
700
CD44+++, CD133 neg.


Konzentrations- und zeitabhängige spezifische in-vitro-Vitalitätsreduktion (%)
in Gegenwart eutherapeutischer Konzentrationen von
Polyphenolen
90%
Polyphenolen (0,1-fache Konz.)
50%
Stabilität der Zellen ohne Medikament
97% Stabilität nach Inkubation


Tumorspheroid forming cells-Konzentrations- und zeitabhängige spezifische in-vitro-Vitalitätsreduktion (%) in Gegenwart eutherapeutischer Konzentrationen von
Polyphenolen
90%
Polyphenolen (0,1-fache Konz.)
70%
Stabilität der Zellen ohne Medikament
95% Stabilität nach Inkubation

Ergebnis vom 16.08.2013
Das eingesandte Untersuchungsmaterial war gut beurteilbar. Es fand sich jetzt nur noch eine gering erhöhte Anzahl im Blut zirkulierender, vitaler tumorverdächtiger Zellen, die sich im Vergleich zum Vorbefund vom Februar 2013 auf ein Achtel reduziert hat. Abgenommen hat der Anteil der Zellen, die zusätzlich Prostataspezifisches Antigen, Prostata-spezifisches-Membran-Antigen, B7-H3 und den Androgenrezeptor tragen. Daneben waren einige spezifische Zellfragmente nachweisbar. Spezifische Zellfragmente treten zum Beispiel im Rahmen immunologischer Abwehrreaktionen als Zeichen der Zellschädigung, aber auch als Zeichen eines hohen Zellumsatzes auf.
Die automatische mikrofluorimetrische Bildanalyse des Prozentsatzes der absterbenden Epithelzellantigen(HEA)-positiven Zellen (zeit- und konzentrationsabhängig), ergab eine Vitalitätsreduktion bei der Kombination der Pflanzenstoffmischungen.
Unter laufender Therapie mit den Polyphenolmischungen zeigte sich zunächst eine stabile Zellzahl, die sich jetzt auf ein niedriges Zellzahlniveau fortsetzt.

Die automatische Bildanalyse des Prozentsatzes der absterbenden Tumorspheroide (zeit- und konzentrationsabhängig), ergab eine 90%ige in-vitro-Vitalitätsreduktion bei den Polyphenolmischungen in der therapeutischen Konzentration.
Mit der Verdünnung auf die 0,1-fache Dosis des Polyphenolgemisches wurde eine deutlich geringere, aber dennoch ebenfalls beachtliche Vitalitätsreduktion der Spheroide erreicht.

Fazit
Zusammenfassend ist durch die Einführung der neuen Zellmarker eine weitergehende Möglichkeit zur Charakterisierung der Bösartigkeit zirkulierender Tumorzellen geschaffen worden.
Die Chemoempfindlichkeitsmessung dieser Zellen ermöglicht eine Individualisierung der konventionellen medikamentösen Tumortherapie und eine Verminderung von Überbehandlung und Nebenwirkungen.
Sie nährt aber durch den vorliegenden Befund auch die Hoffnung, dass die hervorragende Wirkung der Polyphenolmischungen an den zirkulierenden Tumorzellen mit unklarer Bösartigkeit nun im nächsten Schritt bei den tumorstammzellverdächtigen Zellen bestätigt wird. Dies gilt es nun weiter zu untersuchen.


Literaturverzeichnis

  1. Liu,J., Ma, L., Xu, J.et al - Spheroid body - forming cells in the human gastric cancer cell line MKN - 45 possess cancer stem cell properties, Int J Oncol. 2013 Feb; 42 (2): 453 - 9.
  2. Baccelli, I. et al - Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay, Nature Biotechnology 2013; DOI: 10.1038/nbt.2576.
  3. Brustkrebs: Metastasen - Stammzellen entdeckt, news.doccheck.com, 23. 4. 2013
  4. Pizon, M., Zimon, D., Carl, S., et al - Heterogeneity of circulating epithelial tumor cells from individual patients with respect to expression profiles and clonal growth (sphere formation) in breast cancer, ecancer 2013, 7:343 DOI: 10.3332/ecancer.2013.343
  5. Wicha, M., Hayes, D. - Circulating tumor cells: not all detected cells are bad and not all bad cells are detected, J clin oncol 2011; 1508 - 1511.
  6. Rüdiger, N, Stein, E.- L., Schill, E. et al - Chemosensitivity testing of circulating epithelial tumor cells (CETC) in vitro: Correlation to in vivo sensitivity and clinical outcome, Journal of cancer therapy 2013; 4, 597 - 605.
  7. Thalgott, M., Rack, B. - Detection of circulating tumor cells in different stages of prostate cancer, J Cancer Res Clin Oncol 2013; 755 - 763.
  8. Camara, O, Kavallaris, A. et al - Seeding of epithelial cells into circulation during surgery for breast cancer: the fate of malignant and benign mobilized cells, World journal of surgical oncology 2006; 4: 67.
  9. Pachmann, K., Clement, J. et al - Standardized quantification of circulating peripheral tumor cells from lung and breast cancer, Clin Chem Lab Med 2005; 43 (6): 617 - 627.
  10. Pachmann, K., Dengler, R. et al - An increase in cell number at completion of therapy may develop as an indicator of early relapse, J Cancer Res Clin Oncol 2008; 134: 59 - 65.
  11. www.PREFERE.de

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